2012/09/18号◆クローズアップ「単一細胞を用いた癌の洞察」

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NCI Cancer Bulletin2012年9月18日号（Volume 9 / Number 18）

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◇◆◇ クローズアップ ◇◆◇

単一細胞を用いた癌の洞察

癌を解明するための最大の問題点を尋ねられた時、ほぼ1つの言葉が多くの研究者の口から飛び出す。不均一性という言葉である。

研究者らは、腫瘍が同一の特徴をもつ同一の細胞の均質な集塊ではないということを強調する。細胞は、1つの腫瘍の中の部分ごとに全く異なる動きをする。例えば、細胞増殖に重要な遺伝子は、ある領域で活性化されていても、別の領域では不活性である。あるいは、癌細胞の一部の集団が休眠状態にみえても、実際には、侵入しようとする薬剤から隠れているのかもしれない。

この不均一性が、例えば分子標的療法や、疾患のより有効な診断マーカーや予後マーカーを特定する取組みの成功に限界がある原因となっている。

研究者らは、多くの人々が長い間、疑念を抱いていたものを今まさに見出そうとしている。腫瘍全体に不均一性をもたらしているものの大部分は、個々の癌細胞間の大きな不均一性である。

特に各細胞で測定する必要のある重要成分であるDNAおよびRNAが、比較的微量であることから、最近まで、各細胞ごとの詳細な測定はほぼ不可能であった。しかし、それらの限界の克服に有用な技術革新の恩恵により、単一細胞の生物学に踏み込んで探究を始めた研究者が増えている。

現在までに実施された研究により「ある腫瘍内の癌細胞間でどの程度の多様性があるかがわかりました」と、癌細胞間の相互作用ネットワークのマッピングに特化する研究室を主宰するスタンフォード大学の免疫学者Dr.Garry Nolan氏は語る。

しかし、進歩した技術を用いても、単一細胞レベルの研究の実施は困難であり、時間と費用がかさむ可能性がある。しかし、その重要性が増しており、NIH共通基金の活動（補足参照）による5年間9000万ドルの資金助成が得られたことから、今後10年間にわたって単一細胞に関する研究により、癌患者または他の疾患の患者に恩恵があるだろうという楽観的な見方が目立っている。

平均を越えて

腫瘍の分子生物学に関する大部分の研究は、数十、数百、数千もの細胞の混合物を用いる必要がある。その検体には、「腫瘍が実際に存在する環境を形成する免疫細胞、内皮細胞、そしてその他の浸潤細胞が含まれます」とNCIの癌生物学部門のDr.Dan Gallahan氏は説明する。「そのことが、何を示しているのか、より重要なことには、どうやって腫瘍を治療すればいいかについての理解を事実上困難にしています」。

大きな細胞集団の研究結果は、本質的には平均を求めることを意味します、とGallahan氏は続けた。

単一細胞の研究は、「平均に対抗」するやり方である。Fluidigm社の主任研究技官であるDr.Marc Unger氏は、今年初旬に日本で開かれた幹細胞学会で述べた。（Fludigm社は単一細胞解析用の機器を開発しており、ブロード研究所は最近単一細胞ゲノム科学研究センターの設立計画を発表した）

単一細胞分析から重要な臨床的洞察が得られるだろう、とテキサス大学MDアンダーソンがんセンターのDr.Nicholas Navin氏は語った。氏は、単一癌細胞内の遺伝子数の多様性（コピー数の多様性）を調べるために次世代シーケンサーによる解析を用いた。

例えば単一細胞分析は、「化学療法に耐性を示す既存の細胞集団、又は浸潤能または転移能を有するわずかな細胞亜集団の検出に有用です」と氏は言い、「われわれは、また単一細胞のデータを用いて患者腫瘍の不均一性の度合いを測定し、患者の治療効果の予後診断にこの指標を利用できる可能性があります」と続けた。

最近のいくつかの研究結果により、腫瘍の不均一性により示された問題点が強調されている。

例えばBGI（前北京ゲノミクス研究所）の研究者らは、転移性腎癌の男性患者由来の20個の癌細胞および5個の正常細胞のDNAのタンパク質コード領域の配列決定（エキソーム解析）を行った。癌細胞全体にわたり、驚くほどの数の遺伝的多様性が認められ、一方で通常の遺伝子変異との共通点はほとんど認められなかった。

単一細胞分析の大部分は、まだかなり予備的なもので、何らかの臨床的な影響を及ぼす可能性はまだ数年先だろうと研究者らは口を揃える。

「単一細胞データの問題点は、それらが何を意味するのかをまだ本当にわかっていないことです」とマサチューセッツ工科大学のSangeeta氏はNature Biotechnology誌でコメントしている。

そして、大量の細胞集団を用いた研究はすぐにはなくならないだろうと指摘するのはNIH共通基金を管轄する米国国立衛生研究所（NIH）戦略連携事務局の局長Dr.Betsy Wilder氏である。

「そこにある問題全てに対し、単一細胞分析が必要なわけではありません」とWilder氏は強調する。「細胞集団を用いた研究は、その実施が非常に意味のあることなので継続されるでしょう」。

駆動力となる技術

Gallahan氏が「生物の作用単位と呼ぶ」単一細胞に関してより詳しく研究するという関心以上に、技術がこの分野の成長の駆動力となっている。

同じくスタンフォード大学のDr. Stephen Quake氏は、マイクロフルイディクスを適用した先駆者であるが、それは通常微小なチャネルとバルブを用いた小型チップ（よくラボオンチップ装置と称される）を使用し、研究者が単一の細胞を取り出して、個々の細胞を研究することを可能にしている。Fluidigm社の共同設立者であるQuake氏らは、遺伝子発現解析や個々の細胞のRNAまたはDNA塩基配列決定にこれらの装置を使用するようになっている。

Nolan氏の研究には、２つの技術を合わせた複合的手法が含まれている。すなわち、ひとつはフローサイトメトリーの強化法で、細胞をソート（選別）し、単一の細胞群に限定した分析を行う数十年前から行われていた方法である。もうひとつは、生体検体内のタンパク質の定性、定量を行うためによく用いられる質量分析法である。

Nolan氏の研究室では、この「マスサイトメトリー」というトロント大学のDr. Scott Tanner氏が開発した手法を用いて、サイトカイン、成長因子、および多様な薬剤などの異なる刺激に対する個々の細胞の反応性を調べている。チームの作業のほとんどは正常な血液形成細胞の解析に集中している。

彼らは昨年、細胞分化の間に起こるいくつかの微妙な生化学的変化を明らかにした重要な研究をScience誌に発表した。その中で、慢性骨髄性白血病の治療薬であるダサチニブ（スプリセル）が、特定の細胞内活性にどのように影響を及ぼすかも述べている。この研究が、血液癌患者由来の個々の細胞研究の序章になる、とNolan氏は言う。この手法が、研究室で新規薬物を同定し、研究するのに特に有用であることを証明していると氏は考えている。

アリゾナ州立大学内に設置され、NIHのゲノム科学の中核的研究拠点に指定されている微小規模生命科学センター（Microscale Life Sciences Center：MLSC）は、単一細胞研究の最新技術を開発し、利用している。

当センターは、アリゾナ州、ワシントン大学、ブランダイス大学、フレッドハッチンソンがん研究所の研究者らが共同で研究を行っており、マイクロフルイディクス、計算機科学、物理学、工学、生化学などの分野で十分な訓練を受けた研究者が参加している、と研究代表者であるDr. Deirdre Meldrum氏は説明する。

「これらの研究分野のすべてが、われわれが取り組んでいる新たな技術を開発するために必要なのです」と電気工学が専門のMeldrum氏は語る。

その最初の研究で、MLSCは、生きている単一細胞の代謝経路を測定した。個々の細胞の細胞死に対する抵抗性や細胞死への移行に関連する細胞のエネルギー獲得過程である細胞呼吸などを含んでいる。この研究の中心は、Meldrum氏の研究チームの開発によるCellariumという名前の装置である。「各細胞は制御されたチャンバー内に分離され、そこで細胞を攪乱して経時変化を測定します」と、Meldrum氏は説明する。

MLSCやその他の研究者らは単一細胞の造影技術も開発した。MLSCの研究者らは、VisionGate社の開発したCell-CTと呼ばれる装置を用いており、これにより、実物の3次元の細胞特性の正確な測定が可能になるとMeldrum氏は言う。

MLSCの研究者らは、食道腺癌のリスクが高いバレット食道患者由来の異常な食道細胞を調べた。特に、これらの細胞が低酸素状態でどのように反応するかに注目した。

バレット食道の原因となり得る胃酸の逆流は、食道にダメージを与え、「食道上皮層を一時的な低酸素状態へ移行させます」とフレッドハッチンソンの研究員であるDr. Thomas Paulson氏は説明し、次のように続けた。「実際、Cellarium装置は、この低酸素状態で生存し、増殖することができる細胞の変異体を選び出す様子を示す写真を提供し、正常細胞から癌細胞への細胞の変化に影響する要因に関する洞察を示します」。

MLSCでのPaulson氏の研究はバレット食道が中心であるが、彼はこの方法が一般的な癌のリスクを研究する優れたモデル系となると考えている。

「単一細胞レベルで起こる健常細胞を癌細胞に変換する変化の型が理解できれば、リスクを構成するものへの理解が変化すると考えます」とPaulson氏は語る。

さらなる深部への潜入

単一細胞分析は、まだ大きな限界があるというのが、この分野での一般的な認識である。特定の細胞を用いた研究で到達できるのと同じ分子的、構造的な深部に潜入することを可能にする技術進歩が必要である。そして強力なコンピュータプログラムが、単一細胞研究から得たデータの解釈を助けるのに必要である。

さらに、この研究は最終的に、現在単一細胞研究が行われているほぼ人工的な環境での限界から脱出する必要があるとGallahan氏は述べる。「より技術的進歩があれば、この研究を生体内環境で行えるはずです」。

さらに研究が必要だけれども、単一細胞研究から学ぶことができる可能性はとても大きいとNolan氏は考えている。

「細胞集団分析のレベルであったとしても、われわれが正しい意思決定を行い、可能なかぎり学習してきた事実は、単一細胞のレベルに到達した時にも、さらに大きな価値があることを意味しています」と氏は語る。

— Carmen Phillips

【写真下キャプション訳】正常細胞が浸潤癌に進行しているときの細胞の三次元画像。
［画像提供：アリゾナ州立大学Dr.Deirdre Meldrum氏提供］　　《画像原文参照》

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滝川俊和　訳
石井一夫　（ゲノム科学／東京農工大学）　監修　
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